Biotechnologia roślin

biotechnologia

obowiązkowe

w sali

Program ćwiczeń podzielony jest na trzy autonomiczne moduły prowadzone przez trzy Zakłady na Wydziale Biologii UW. W module pierwszym prezentowane są techniki transformacji glonów na przykładzie C. merolae i C. subellipsoidea. Studenci zapoznają się z technikami selekcji mutantów i weryfikacji poprawności mutagenezy oraz metodami długotrwałego przechowywania komórek glonów. W module drugim studenci zapoznają się zarówno z technikami inżynierii genetycznej, jak i opierającymi się na nowoczesnej wiedzy biologicznej metodami poprawy parametrów użytkowych w uprawach roślin. Studenci porównają efekty fenotypowe mutacji uzyskanych różnymi technikami (mutageneza, edycja genów), a także poznają proces projektowania chemicznych regulatorów wzrostu. W module trzecim studenci wykonają transformację roślin wyższych na przykładzie tytoniu z wykorzystaniem bakterii A. tumefaciens. Przeprowadzą analizę molekularną uzyskanych roślin oraz analizę fenotypową.

Część praktyczną poprzedzać będzie wprowadzenie teoretyczne.

*) Program ćwiczeń w module pierwszym

Wstęp teoretyczny:

Zastosowanie glonów w biotechnologii - zalety i wady wykorzystania glonów na tle roślin wyższych i w porównaniu do prokariotów w produkcji żywności, biopaliw, farmaceutyków, kosmetyków, wartościowych związków chemicznych, ochronie środowiska. Zalety i wady transformacji genomu jądrowego versus plastydowego (chloroplastów). Metody transformacji glonów: elektroporacja, szok osmotyczny, bombardowanie biolistyczne (strzelba genowa). Markery selekcyjne i metody selekcji uzyskanych linii mutantów glonów, metody weryfikacji wprowadzonej mutacji/ ekspresji transgenu. Metody izolacji DNA z komórek glonów, metody długotrwałego przechowywania komórek glonów.

Część praktyczna:

Ćw. 1. Transformacja krasnorostu C. merolae metodą szoku osmotycznego z wykorzystaniem glikolu polietylowego.

Ćw. 2. Transformacja C. subellipsoidea metodą elektroporacji (elektrotransformacja). Wpływ parametrów napięcia i odległości elektrod w celu określenia praktycznego ich wpływu na wydajność transformacji. Wysianie transformowanych hodowli na podłoże stałe.

Ćw. 3. Transformacja z wykorzystaniem strzelby genowej zielenicy C. subellipsoidea. Wpływ parametrów ciśnienia i odległości na wydajność transformacji. Wysianie transformowanych hodowli na podłoże stałe.

Ćw. 4. Metody izolacja DNA z komórek glonów oraz metody przechowywania długotrwałego przechowywania komórek glonów. Liczenie kolonii. Podsumowanie.

*) Program ćwiczeń w module drugim:

Część teoretyczna:

Selekcja nowych odmian roślin na podstawie analizy markerów molekularnych, metody analizy polimorfizmów odpowiedzialnych za naturalną zmienność cech ważnych z punku widzenia użytkowego (GWAS, genome-wide association studies). Konstrukcja roślin transgenicznych oraz edytowanie genomów roślinnych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Zastosowanie roślin transgenicznych oraz odmian otrzymanych metodą CRISPR/Cas9. Biologia chemiczna i jej zastosowania w biotechnologii roślin - działanie klasycznych regulatorów wzrostu roślin takich jak hormony roślinne lub ich inhibitory, a także procesy służące opracowaniu nowych regulatorów, m.in. badania przesiewowe bibliotek cząsteczek chemicznych oraz projektowanie celowanych inhibitorów białek; wykorzystanie linii Arabidopsis wyrażających gen reporterowy do analizy aktywności badanych inhibitorów.

Część praktyczna:

Ćw. 1. Porównanie linii Arabidopsis z mutacją inercyjną oraz delecją wygenerowaną metodą CRISPR/Cas9. Charakterystyka badanych linii za pomocą genotypowania transgenu T-DNA oraz delecji CRISPR, badania poziomu ekspresji wybranych genów, badania poziomu białka za pomocą western-blot.

Ćw. 2. Analiza działania chemicznych regulatorów wzrostu. Klasyczne regulatory wzrostu - gibereliny oraz inhibitory biosyntezy giberelin. Analiza fenotypów mutantów Arabidopsis niezdolnych do biosyntezy giberelin oraz posiadających hiperaktywną ścieżkę sygnalizacji tego hormonu. Demonstracja screen`u fenotypowego na działanie nowych cząsteczek chemicznych - potencjalnych regulatorów wzrostu

*)Program ćwiczeń w module trzecim:

Wstęp teoretyczny:

Zastosowani transgenicznych roślin wyższych w biotechnologii i nauce. Plazmidy używane do transformacji roślin wyższych oraz metody otrzymywania pożądanych konstrukcji genowych.Metody transformacji roślin wyższych, szczegółowe omówienie metod wykorzystujących bakterię Agrobacterium tumefaciens. Zasady wyprowadzania niezależnych linii transgenicznych i ich analizy.

Część praktyczna

Ćw. 1: (a) Konstrukcja plazmidu do transformacji roślin z wykorzystaniem rekombinacji DNA (system Gateway). (b) Transformacja E.coliproduktem reakcji rekombinjacji. (c)

Transformacja stabilna tytoniu przy użyciu bakteriiAgrobacteriumtumefaciens zawierającym wybrane konstrukty – inkubacja eksplantatów z bakteriami.

Ćw. 2:(a) PCR kolonijny na koloniach E. coliotrzymanych po transformacji konstruktem otrzymanym w "systemie Gateway" (kontynuacja ćw. 1a i 1b). (b) Porównanie fenotypu wybranych linii transgenicznych będących w posiadaniu zakładu z roślinami nietransgenicznymi – rozpoczęcie uprawy w warunkach różnicujących fenotyp.

Ćw. 3:(a) Wyprowadzanie roślin transgenicznych - pasaż eksplantatów na świeżą pożywkę (kontynuacja ćw. 1c). (b) Analiza produktów PCR kolonijnego(kontynuacja ćw. 2a). (c) Porównanie fenotypu wybranych linii transgenicznych z roślinami nietransgenicznymi – analiza różnic (kontynuacja ćw. 2b). (d) Izolacja RNA z roślin poddanych analizie fenotypowej (syntezęcDNA wykonają prowadzący poza zajęciami)

Ćw. 4: (a) Analiza tkankowo-specyficznej aktywność promotora przy użyciu genu reporterowego GUS – jako przykład roślin wykorzystywanych w badaniach naukowych. (b) Analiza różnic w ekspresji wybranych endogenów pomiędzy roślinami transgenicznymi i nietransgenicznymi z wykorzystaniem reakcjiPCR w czasie rzeczywistym (kontynuacja ćw. 3d).

Ćw. 5: (a) Wyprowadzanie roślin transgenicznych - pasaż eksplantatów/regeneranów na świeżą pożywkę z pobraniem tkanki do dalszych analiz molekularnych (kontynuacja ćw. 3a). (b) Analiza obecności transgenu w uzyskanych regenerantach - izolacja DNA z pobranych fragmentów regenerantów (reakcję PCR wykonają prowadzący poza zajęciami). (c) Test segregacji transgenu - wysianie nasion różnych linii transgenicznych na pożywkę z czynnikiem selekcyjnym.

Ćw. 6:(a) Analiza obecności transgenu w uzyskanych regenerantach – żel z wynikami PCR (kontynuacja ćw. 5b). (b) Wyniki testu segregacji transgenu (kontynuacja ćw. 5c). (c) Omówienie wyników analizy różnic w ekspresji endogenów pomiędzy roślinami transgenicznymi a nietransgenicznymi (kontynuacja ćw. 4d), (d) Analiza tkankowo-specyficznej aktywność promotora przy użyciu genu reporterowego GUS - omówienie wyników reakcji barwnej (kontynuacja ćw. 4a).

Podręczniki:

• Biotechnologia roślin, PWN, redakcja S. Malepszego, 2014.

• Plant Transformation Technologies. Neal S.C., Touraev A., Citovsky V., Tzfira T., Wiley-Blackwell, 2010.

• Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications 2nd Edition. Stewart C. Neal Jr., Wiley-Blackwell 2016.

• Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols. Balbás P., Lorence A., Springer, 2012.

• Genetic Transformation of Plants. Jackson J. F., Linskens H.F., Springer, 2003

• Advances in New Technology for Targeted Modification of Plant Genomes. Zhang F., Puchta H., Thomson J. G., Springer, 2015.

• Transgenic Plants: Methods and Protocols. Peña L., Springer, 2005.

• Algae Biotechnology: Products and Processes. Bux F., Chisti Y. Springer, 2016

• Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.

Wiedza.

Student:

Wykazuje znajomość podstawowych technik i narzędzi w badaniach zjawisk przyrodniczych i rozumie znaczenie pracy doświadczalnej w biotechnologii oraz potrafi opisać znaczenie analiz molekularnych w badaniach z zakresu biotechnologii roślin (K_W04).

Ma wiedzę dotyczącą wykorzystania technicznych i technologicznych aspektów biotechnologii (K_W05).

Zna podstawowe techniki laboratoryjne oraz pomiarowe i obrazowe, stosowane w badaniach chemicznych, mikrobiologicznych, genetycznych i biologii molekularnej i wykorzystywanych w biotechnologii roślin (K_W14).

Ma elementarną wiedzę z zakresu biotechnologii roślin oraz rozumie związki i zależności między różnymi dyscyplinami przyrodniczymi (K_W01).

Ma podstawową wiedzę z zakresu ochrony własności intelektualnej (K_W10).

Umiejetności.

Student:

Stosuje podstawowe techniki, właściwe dla biotechnologii roślin (K_U01).

Przeprowadza proste zadania badawcze lub ekspertyzy pod okiem opiekuna (K_U04).

Stosuje podstawowe techniki i narzędzia badawcze biologii doświadczalnej oraz umie wyjaśnić zasady ich działania (K_U01).

Wykazuje umiejętność poprawnego wnioskowania na podstawie danych z różnych źródeł (K_U06).

Kompetencje społeczne.

Student:

Wykazuje zdolność do efektywnej pracy w zespole (K_K04).

Wykazuje zrozumienie zjawisk i procesów biologicznych w przyrodzie (K_K01).

Wykazuje odpowiedzialność za własną pracę i powierzony sprzęt; wykazuje poszanowanie pracy własnej i innych (K_K03).

Rozumie potrzebę przekazywania społeczeństwu informacji o nowych osiągnięciach biotechnologii i potrafi przekazać te informacje w sposób zrozumiały (K_K06).

Kryteria oceny z laboratorium:

(i) uczestniczył w co najmniej 85 procentach zajęć;

(ii) pracował w sposób, który pozytywnie ocenia wiedzę, umiejętności i kompetencje społeczne, które w trakcie uzyskanych działań (opisane w sylabusie jako przedmiotowe efekty uczenia się).

Szczegółowe kryteria oceny z laboratorium:

(i) aktywność w laboratorium;

(ii) Przygotowanie prezentacji na wybrany/wylosowany temat w 2-3 osobowych grupach i jej prezentacja prowadzącym i studentom odbywającym ćwiczenia. Uzyskanie minimum 51% ogólnej liczby punktów za prezentację.

Warunkiem przystąpienia do egzaminu jest pozytywna ocena zaliczenia ćwiczeń

Warunkiem zdania egzaminu jest:

(i) przystąpienie do egzaminu pisemnego

(ii) uzyskanie co najmniej 61% ogólnej liczby punktów.

Ocena z egzaminu jest jednocześnie oceną z ćwiczeń.

Nie dotyczy