Biotechnologia roślin

biotechnologia

obowiązkowe

w sali

Program ćwiczeń podzielony jest na trzy autonomiczne moduły prowadzone przez trzy Zakłady na Wydziale Biologii UW. W module pierwszym prezentowane są techniki transformacji glonów na przykładzie C. merolae i C. subellipsoidea. Studenci zapoznają się z technikami selekcji mutantów i weryfikacji poprawności mutagenezy oraz metodami długotrwałego przechowywania komórek glonów. W module drugim studenci zapoznają się zarówno z technikami inżynierii genetycznej, jak i opierającymi się na nowoczesnej wiedzy biologicznej metodami poprawy parametrów użytkowych w uprawach roślin. Studenci porównają efekty fenotypowe mutacji uzyskanych różnymi technikami (mutageneza, edycja genów), a także poznają proces projektowania chemicznych regulatorów wzrostu. W module trzecim studenci wykonają transformację roślin wyższych na przykładzie tytoniu z wykorzystaniem bakterii A. tumefaciens. Przeprowadzą analizę molekularną uzyskanych roślin oraz analizę fenotypową.

*) Program ćwiczeń w module pierwszym

Wstęp teoretyczny:

Zastosowanie glonów w biotechnologii - zalety i wady wykorzystania glonów na tle roślin wyższych i w porównaniu do prokariotów w produkcji żywności, biopaliw, farmaceutyków, kosmetyków, wartościowych związków chemicznych, ochronie środowiska. Zalety i wady transformacji genomu jądrowego versus plastydowego (chloroplastów). Metody transformacji glonów: elektroporacja, szok osmotyczny, bombardowanie biolistyczne (strzelba genowa). Markery selekcyjne i metody selekcji uzyskanych linii mutantów glonów, metody weryfikacji wprowadzonej mutacji/ ekspresji transgenu. Metody izolacji DNA z komórek glonów, metody długotrwałego przechowywania komórek glonów.

Część praktyczna:

Ćw. 1. Transformacja krasnorostu C. merolae metodą szoku osmotycznego z wykorzystaniem glikolu polietylowego.

Ćw. 2. Transformacja zielenic i krasnorostów metodą elektroporacji (elektrotransformacja). Wpływ parametrów napięcia i odległości elektrod w celu określenia praktycznego ich wpływu na wydajność transformacji.

Ćw. 3. Transformacja z wykorzystaniem strzelby genowej zielenic i krasnorostów. Wpływ parametrów ciśnienia i odległości na wydajność transformacji.

Ćw. 4. Metody izolacja DNA z komórek glonów oraz metody przechowywania długotrwałego przechowywania komórek glonów. Liczenie kolonii. Podsumowanie.

*) Program ćwiczeń w module drugim:

Część teoretyczna:

1. Ekspresja i izolacja białek w układach roślinnych.

2. Biologia chemiczna i jej zastosowania w biotechnologii roślin - działanie klasycznych

regulatorów wzrostu roślin takich jak hormony roślinne lub ich inhibitory, projektowanie

celowanych inhibitorów białek.

3. Selekcja nowych odmian roślin na podstawie analizy markerów molekularnych, metody

analizy polimorfizmów odpowiedzialnych za naturalną zmienność cech ważnych z punku

widzenia użytkowego.

Część praktyczna:

Ćw. 1.

1. Izolacja białek z roślin tytoniu wyrażających białka w fuzji z GFP. Oczyszczanie białka

fuzyjnego z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa.

2. Przygotowanie testów wzrostowych roślin w hodowli in vitro.

Ćw. 2.

1. Rozdział elektroforetyczny białek wyizolowanych z linii tytoniu. Analiza wyników.

2. Obserwacje mikroskopowe białek fluorescencyjnych wyrażanych w systemach roślinnych.

3. Analiza wyników testów wzrostowych i omówienie działania chemicznych regulatorów

wzrostu.

*)Program ćwiczeń w module trzecim:

Wstęp teoretyczny:

Zastosowani transgenicznych roślin wyższych w biotechnologii i nauce. Plazmidy używane do transformacji roślin wyższych oraz metody otrzymywania pożądanych konstrukcji genowych. Metody transformacji roślin wyższych, szczegółowe omówienie metod wykorzystujących bakterię Agrobacterium tumefaciens. Zasady wyprowadzania niezależnych linii transgenicznych i ich analizy.

Część praktyczna

Ćw. 1: (cz.a) Konstrukcja plazmidu do transformacji roślin z wykorzystaniem rekombinacji DNA (system Gateway). Transformacja E.coli produktem reakcji rekombinjacji. (cz.b)

Transformacja stabilna tytoniu przy użyciu bakterii Agrobacteriumtumefaciens zawierającym wybrane konstrukty – inkubacja eksplantatów z bakteriami.

Ćw. 2: (cz.a) PCR kolonijny na koloniach E. coli otrzymanych po transformacji konstruktem otrzymanym w "systemie Gateway" (kontynuacja cz.a z ćw.1). (cz. b) Wyprowadzanie roślin transgenicznych - pasaż eksplantatów na świeżą pożywkę (kontynuacja - cz.b z ćw.1).

Ćw. 3: (cz.a) Analiza produktów PCR kolonijnego - omówienie wyników (kontynuacja cz.a z ćw.2). (cz.b) Wyprowadzanie roślin transgenicznych - obserwacja i pasaż eksplantatów na świeżą pożywkę (kontynuacja cz.b - ćw.2). (cz.c) Analiza tkankowo-specyficznej aktywność promotora przy użyciu genu reporterowego GUS – jako przykład roślin wykorzystywanych w badaniach naukowych. (cz.d) Porównanie fenotypu wybranych linii transgenicznych będących w posiadaniu zakładu z roślinami nietransgenicznymi – rozpoczęcie uprawy w warunkach różnicujących fenotyp.

Ćw. 4: (cz.c) Analiza tkankowo-specyficznej aktywność promotora przy użyciu genu reporterowego GUS – omówienie wyników reakcji barwnej (kontynuacja cz.c z ćw.3). (cz.d) Porównanie fenotypu wybranych linii transgenicznych z roślinami nietransgenicznymi – analiza różnic. Izolacja RNA z roślin poddanych analizie fenotypowej (syntezę cDNA wykonają prowadzący poza zajęciami) (kontynuacja cz.d z ćw.3).

Ćw. 5: (cz.b) Wyprowadzanie roślin transgenicznych - obserwacja i pasaż eksplantatów/regeneranów na świeżą pożywkę z (kontynuacja cz.b z ćw.3) (cz.d) Analiza różnic w ekspresji wybranych endogenów pomiędzy roślinami transgenicznymi i nietransgenicznymi z wykorzystaniem reakcji PCR w czasie rzeczywistym (kontynuacja cz.d z ćw.4). (cz.e) Test segregacji transgenu - wysianie nasion różnych linii transgenicznych na pożywkę z czynnikiem selekcyjnym.

Ćw. 6: (cz.b) Wyprowadzanie roślin transgenicznych - obserwacja i pasaż eksplantatów na pożywkę ukorzeniającą (kontynuacja cz. b - ćw.5) (cz. d) Omówienie wyników analizy różnic w ekspresji endogenów pomiędzy roślinami transgenicznymi a nietransgenicznymi (kontynuacja cz.d z ćw.5), (c) Wyniki testu segregacji transgenu (kontynuacja cz.e z ćw.5).

Podręczniki:

• Biotechnologia roślin, PWN, redakcja S. Malepszego, 2014.

• Plant Transformation Technologies. Neal S.C., Touraev A., Citovsky V., Tzfira T., Wiley-Blackwell, 2010.

• Plant Biotechnology and Genetics: Principles, Techniques, and Applications 2nd Edition. Stewart C. Neal Jr., Wiley-Blackwell 2016.

• Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols. Balbás P., Lorence A., Springer, 2012.

• Genetic Transformation of Plants. Jackson J. F., Linskens H.F., Springer, 2003

• Advances in New Technology for Targeted Modification of Plant Genomes. Zhang F., Puchta H., Thomson J. G., Springer, 2015.

• Transgenic Plants: Methods and Protocols. Peña L., Springer, 2005.

• Algae Biotechnology: Products and Processes. Bux F., Chisti Y. Springer, 2016

• Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.

Wiedza.

Student:

Wykazuje znajomość podstawowych technik i narzędzi w badaniach zjawisk przyrodniczych i rozumie znaczenie pracy doświadczalnej w biotechnologii oraz potrafi opisać znaczenie analiz molekularnych w badaniach z zakresu biotechnologii roślin (K_W04).

Ma wiedzę dotyczącą wykorzystania technicznych i technologicznych aspektów biotechnologii (K_W05).

Zna podstawowe techniki laboratoryjne oraz pomiarowe i obrazowe, stosowane w badaniach chemicznych, mikrobiologicznych, genetycznych i biologii molekularnej i wykorzystywanych w biotechnologii roślin (K_W14).

Ma elementarną wiedzę z zakresu biotechnologii roślin oraz rozumie związki i zależności między różnymi dyscyplinami przyrodniczymi (K_W01).

Ma podstawową wiedzę z zakresu ochrony własności intelektualnej (K_W10).

Umiejetności.

Student:

Stosuje podstawowe techniki, właściwe dla biotechnologii roślin (K_U01).

Przeprowadza proste zadania badawcze lub ekspertyzy pod okiem opiekuna (K_U04).

Stosuje podstawowe techniki i narzędzia badawcze biologii doświadczalnej oraz umie wyjaśnić zasady ich działania (K_U01).

Wykazuje umiejętność poprawnego wnioskowania na podstawie danych z różnych źródeł (K_U06).

Kompetencje społeczne.

Student:

Wykazuje zdolność do efektywnej pracy w zespole (K_K04).

Wykazuje zrozumienie zjawisk i procesów biologicznych w przyrodzie (K_K01).

Wykazuje odpowiedzialność za własną pracę i powierzony sprzęt; wykazuje poszanowanie pracy własnej i innych (K_K03).

Rozumie potrzebę przekazywania społeczeństwu informacji o nowych osiągnięciach biotechnologii i potrafi przekazać te informacje w sposób zrozumiały (K_K06).

Kryteria oceny z laboratorium:

(i) uczestniczył w co najmniej 85 procentach zajęć;

(ii) pracował w sposób, który pozytywnie ocenia wiedzę, umiejętności i kompetencje społeczne, które w trakcie uzyskanych działań (opisane w sylabusie jako przedmiotowe efekty uczenia się).

Szczegółowe kryteria oceny z laboratorium:

(i) aktywność w laboratorium;

(ii) Przygotowanie prezentacji na wybrany/wylosowany temat w 2-3 osobowych grupach i jej prezentacja prowadzącym i studentom odbywającym ćwiczenia. Uzyskanie minimum 51% ogólnej liczby punktów za prezentację.

Warunkiem przystąpienia do egzaminu jest pozytywna ocena zaliczenia ćwiczeń

Warunkiem zdania egzaminu jest:

(i) przystąpienie do egzaminu pisemnego

(ii) uzyskanie co najmniej 61% ogólnej liczby punktów.

Ocena z egzaminu jest jednocześnie oceną z ćwiczeń.

Nie dotyczy